Connect.Gene
Caraterização genética
[Em construção]
Marcadores ISSR
O marcador molecular dominante usado no âmbito do Connect.Gene
Por que escolhemos os marcadores ISSR
Os marcadores ISSR (inter-simple sequence repeat) amplificam uma sequência de ADN delimitada por duas regiões microssatélites invertidas, e são abundantes ao longo do genoma de seres eucarióticos, sendo intensamente utilizados em estudos de genética populacional (Barth et al., 2002).
Este tipo de marcadores são fáceis de usar, de baixo custo e metodologicamente menos exigentes do que outros marcadores dominantes, sendo referidos como ideais para uso em organismos em que a informação genética seja deficiente e para utilizadores que tenham pouca experiência no âmbito de biologia molecular (Ng e Tan, 2015).
No caso do projeto Connect.Gene estes marcadores foram escolhidos pelo facto das espécies em estudo não apresentarem outro tipo de marcadores disponíveis, por serem endémicas dos Açores, e também porque a metodologia era apenas para determinar valores indicativos para futura comparação com a RAD-seq, que nos dará resultados muito mais profundos e precisos. Este conceito foi adotado uma vez que os autores Ng e Tan (2015) indicam que, apesar dos potenciais constrangimentos dos ISSR tais como reprodutibilidade, homologia e dominância, os marcadores dominantes são úteis para avaliações iniciais de variação genética em qualquer espécie, mas especialmente em espécies endémicas e pouco ou nada estudadas a nível genético como as abrangidas pelo Connect.Gene.
Considerações sobre os ISSR
01
Marcadores dominantes, produzem menos informação genética por locus quando comparada com marcadores codominantes, no entanto ultrapassável usando maior número de loci.
02
Deverão ser utilizadas apenas as bandas reproduzíveis, as bandas que não são reproduzíveis em várias repetições do PCR, numa mesma amostra, deverão ser deixadas de fora.
03
A homologia em marcadores dominantes, embora ainda possa ser uma questão de precisão, mostrou não ser tão má como não mostrar nem utilizar resultados de marcadores dominantes.
Escolha do ISSR para cada espécie no Connect.Gene
Para cada espécie foram testados
19 ISSR, dos quais foram otimizados de acordo com o seguinte protocolo, proposto pelos autores Ng e Tan (2015):
PCR e qualidade do ADN
Um PCR normal envolve um par de primers, quando se usam ISSR há uma alteração, ou seja, é apenas usado um primer. Este primer único atua em ambos os sentidos do ADN, que é condição essencial para a amplificação de fragmentos de ADN pela técnica de PCR.
Normalmente o ADN genómico é o material genético utilizado para o ISSR-PCR, e que necessita de ser de
elevada qualidade para que o procedimento ocorra nas melhores condições. Normalmente
10-50ng de ADN de boa qualidade é suficiente para reações de ISSR-PCR.
À semelhança com qualquer outro tipo de marcadores, os primers de ISSR apresentam uma temperatura de hibridação ou de ligação ao ADN, normalmente entre 45-60ºC, que têm que ser otimizadas e determinadas para cada espécie em estudo em cada projeto, uma vez que esta temperatura varia de acordo com a espécie e de acordo com a qualidade de ADN disponível na amostra. Esta
temperatura ajustada ao ADN disponível irá permitir que o PCR produza bandas límpidas e repetíveis, garantindo que as bandas amplificadas não são artefactos de PCR de fraca qualidade.
Desafios e limitações dos ISSR
Enquanto resultados da genotipagem por ISSR possam ser reproduzíveis dentro de um estudo usando o mesmo equipamento e protocolos, Ng e Tan (2015) recomendam cautela quando comparando padrões de bandas entre estudos diferentes. Mesmo quando dois estudos isolados sejam na mesma espécie usando os mesmos primers, o padrão de bandas pode variar consideravelmente. A razão ainda não está totalmente esclarecida, mas acredita-se que se deverá aos efeitos de usar reagentes diferentes de marcas e fabricantes diferentes, a definições diferentes durante o PCR e/ou a diferentes critérios de escolha das bandas a estudar, que é dependente de cada investigador.
Neste aspeto, é de extrema importância, na escrita de artigos científicos, que o protocolo exato utilizado seja descrito, nomeadamente segundo Crawford et al. (2012) :
- Descrição detalhada de todos os passos ao longo do protocolo ISSR.
- Nomes e sequências dos primer ISSR usados, assim como das reações de PCR.
- Padrões e critérios usados para assegurar a fiabilidade da genotipagem e escolha das bandas, i.e. selecionando apenas loci/bandas que sejam claras, não ambíguas, e reproduzíveis através de experiência replicada.
-
Número e proporção de amostras usadas nas experiências replicadas.
Visualização
dos resultados
Determinação de bandas elegíveis para análise e recolha de dados ISSR
Os critérios para determinação e escolha de bandas originadas de marcadores dominantes são subjetivos e dependem de utilizador para utilizador (Pompanon et al., 2005). No entanto para evitar enviesamentos, existem alguns critérios que deverão ser seguidos:
Escolher apenas bandas claramente distintas
As bandas “esborratadas” deverão ser deixadas de parte uma vez que podem representar produtos inespecíficos e não desejados ou podem representar a sobreposição de várias bandas de tamanhos semelhantes.
Escolher bandas com uma forte intensidade
As bandas com fraca intensidade tendem a não ser reproduzíveis, logo deverão ser evitáveis.
Estabelecer uma amplitude de dispersão de bandas
Ou seja, definir o tamanho máximo e mínimo de bandas, acima e abaixo dos quais toda e qualquer banda, independentemente da sua intensidade, deverá ser descartada. A amplitude normalmente usada é entre os 100 e 2000bp (Ng e Tan, 2015).
No entanto neste projeto o tamanho máximo foi aumentado, uma vez que se verificou que muitas bandas acima de 2000bp eram perfeitamente identificáveis, isoladas, com forte intensidade e reproduzíveis. Desta forma puderam ser utilizadas na análise de dados.
Cada banda identificada através de ISSR representa um locus, ou seja, uma posição no ADN da espécie. O número total de bandas representa o número total de bandas de tamanhos diferentes observadas em todas as amostras num estudo, ou seja, o número total de locus identificados no conjunto de todas as amostras em estudo.
Análise dos dados ISSR
Número de bandas mínimo
O número de bandas disponíveis para análise é uma questão importante uma vez que influencia os resultados e conclusões finais. Poucas bandas irão afetar negativamente a qualidade da análise e a capacidade de atingir os objetivos do projeto (Ng e Tan, 2015).
Para estudos de estimativa de diversidade genética, Mariette et al. (2002) mostraram que pelo menos 4-10 vezes mais loci dominantes deverão ser usados para obter o mesmo nível de estimativa de quando usando marcadores codominantes. No caso do Connect.Gene esta informação não é aplicável porque não há marcadores codominantes disponíveis para as espécies em estudo.
Segundo Nelson e Anderson (2013), a
diferenciação genética entre populações é o fator mais importante quando a
decidir o número de bandas a usar. A análise AMOVA, que calcula a estrutura genética entre populações, é considerada fiável quando se baseia em dados obtidos a partir de 30-50 bandas. Esta indicação foi a seguida pelo projeto Connect.Gene como guia para a escolha do número de bandas a usar. Da mesma forma Nybom (2004) sugere que para estimar a diversidade genética intraespecífica em plantas se deverá utilizar em média 54.9 bandas/locus por estudo, como mínimo para uma estimativa apurada.
Resultados com ISSR
Os resultados de ISSR foram analisados como marcador dominante em sistema binário. Os padrões de bandas no sistema binário são classificados com presente ou ausente. Todos os resultados foram analisados considerando populações, ilhas e par de população.
Depois de considerar e comparar os resultados de ambas as réplicas de amostras processadas, há sempre informação que não se consegue confirmar, sendo por isso considerada como informação omissa. No total por população foi permitido um
máximo 30% de dados omissos. Todas as bandas de marcador que apresentaram uma taxa superior a 30%, foram automaticamente retiradas da análise de dados, mesmo que para todas as outras populações este valor estivesse abaixo dos 30%.
Pearson´s e relação com o tamanho amostral
Quando comparando resultados entre populações com tamanho amostral desigual, é necessário considerar se o número de amostras colhida poderá influenciar o resultado final, e os valores dos índices em estudo. Para determinar se há ou não influência do tamanho amostral no produto final é necessário recorrer ao coeficiente de Pearon's, que é um índice estatístico que correlaciona os resultados com o número de amostras por população. Todas as populações que mostraram que o número de indivíduos colhidos influenciam diretamente os resultados, foram retirados da análise de dados.
Índices
PCR - Polymerase Chain Reaction
O que é
A Reação em cadeia da polimerase ou Polymerase Chain Reaction (PCR) é uma técnica utilizada em biologia molecular para, in vitro, ou seja em laboratório, gerar milhões de cópias de um determinado fragmento de ADN.
Aplicações da PCR
Biologia molecular
ex: clonagem, manipulação e sequenciação de genes, deteção de mutações
Diagnósticos médicos
ex: deteção de doenças hereditárias, patogéneos (vírus, bactérias)
Ecologia
ex: determinação de diversidade genética, fluxo de genes, nível de comunicação entre populações
Análise forense
ex: amplificação de ADN em cenário criminal e de ADN antigo
Relações de parentesco
ex: testes de paternidade, nível de consanguinidade ou inbreeding
Análise filogenética
ex: proximidade genética entre populações ou espécies, identificação de novos organismos
Análise funcional de genes
ex: determinar o efeito de mutações na funcionalidade de um gene
Porquê ampliar cópias de ADN?
O PCR é utilizado para obter uma
amplificação seletiva de uma região do ADN, com interesse para determinado estudo.
Estas regiões podem ser
genes específicos, conhecidos por provocarem determinada característica no indivíduo/espécie;
genes aleatórios, conhecidos ou não;
zonas intergénicas (entre genes), conhecidas ou não; ou
zonas aleatórias do ADN.
A escolha do tipo de região a amplificar depende do objetivo do estudo em questão.
O objetivo é “fabricar” cópias da região de interesse do ADN, em quantidade suficiente que possa ser analisada convenientemente.
Reagentes para realizar um PCR
ADN do organismo
em estudo, que contém o(s) fragmento(s) de ADN a copiar/amplificar
Dois primers
específicos do(s) fragmento(s) de ADN a copiar; os primers são selecionados de antemão e são geralmente encomendados a um laboratório ou fornecedor comercial
Nucleótidos
que são os blocos de construção para fazer as cópias desejadas do ADN. Também são designados de desoxinucleósidos trifosfatos ou dNTPs.
Polimerase
que é uma enzima que polimeriza/sintetiza/copia as novas cadeias/fragmentos de ADN. Normalmente usada a Taq polimerase
Solução tampão
que fornece o ambiente químico adequado para a atividade ótima de todos os reagentes
Onde se realiza o PCR (equipamento base)
Todos os reagentes são colocados e misturados, nas proporções otimizadas para o estudo, nos chamados tubos de PCR, que são pequenos tubos com volumes entre os 0,2 e 0,5 ml.
É necessário um tubo por cada indivíduo em estudo. Depois de misturados os reagentes, a solução é colocada nos tubos.
Estes são colocados no termociclador, que promove ciclos de variações de temperaturas ótimas para que ocorra a cópia/amplificação dos fragmentos de ADN, ou seja, para que o PCR ocorra nas melhores condições.
Cada ciclo é composto por três etapas com diferentes temperaturas:
Desnaturação
A solução nos tubos PCR é aquecida para que haja a separação das cadeias complementares de ADN em cadeias simples. Geralmente ocorre a 95ºC, por um período de tempo otimizado para cada procedimento. Normalmente ronda 1 minuto.
Hibridação
Os primers ligam-se às cadeias simples de ADN, na zona alvo para a qual foram desenhados. A temperatura a que ocorre a hibridação pode variar entre 48ºC e 62ºC e está dependente da constituição interna dos primers.
Extensão
A Taq polimerase liga-se onde os primers estão acoplados ao ADN e copia o fragmento. Esta fase ocorre a 72ºC e pode ter a duração entre 1 minuto a 2,5 minutos.
Onde se realiza o PCR (equipamento base)
São necessários vários ciclos para amplificar milhões de cópias do fragmento alvo de ADN.
A fórmula usada para calcular, de um modo simples, o número de cópias de ADN formadas após um determinado número de ciclos é 2^n, onde n é o número de ciclos.
ex: Uma reação PCR com 30 ciclos resulta em 2^30, ou seja 1.073.741.824 cópias da região original.
Como promover resultados de PCR fiáveis?
Evitar contaminação entre amostras e dos resultados
O correto manuseamento do material de laboratório é crucial para que os resultados sejam qualificáveis
Usar sempre controlos negativos e controlos positivos em cada protocolo
Controlos negativos: tubos PCR com todos os reagentes mas sem amostra de ADN. Havendo amplificação de ADN nestes tubos, onde não deveria haver, significa que nenhuns dos outros resultados poderão ser fiáveis.
Controlos positivos: tubos de PCR com amostras de ADN que se sabe serem amplificáveis pelos primers selecionados. A não amplificação nestes tubos, significa que não poderemos ter certeza das amplificações respeitantes às outras amostras de ADN.
Promover uma otimização das melhores condições de PCR
As quantidades e concentrações dos reagentes, e as temperaturas de hibridação dos primers são fatores cruciais para um bom PCR.
O número de ciclos e o tempo para cada fase de PCR também são muito importantes para que o PCR ocorra nas melhores condições.
Evitar erro humano
A máxima atenção por parte do operador é muito importante, uma vez que este controla todos os fatores anteriormente mencionados.
Algumas razões para que um PCR corra mal
Mutações no local de hibridação dos primers
Se o local onde os primers se deveriam ligar apresentar mutações, faz com que os primers não consigam hibridar, logo há uma amplificação defeituosa do fragmento em estudo. Este fator não pode ser controlado por quem faz o PCR.
ADN de fraca qualidade com muitos contaminantes
É importante ter ADN de boa qualidade, puro e sem contaminantes. Os contaminantes influenciam a qualidade da reação PCR e dos produtos amplificados.
Esquecimento em colocar algum dos reagentes necessários ao PCR
Todos os reagentes mencionados são essenciais ao PCR, a falta de um significa a não amplificação dos fragmentos.
Reagentes acondicionados defeituosamente
Todos os reagentes para um PCR necessitam de ser guardados em refrigeração, ou então a capacidade dos mesmo fica comprometida.
Quantidades de reagentes erradas
Todos os reagentes deverão ser medidos com precisão, o excesso ou defeito nas quantidades influencia diretamente a capacidade amplificadora do PCR.
Depois do PCR
o que acontece?
Depois de concluído o PCR, é tempo de passar para as fases seguintes, que incluem:
- Determinar se o PCR ocorreu nas melhores condições
- Visualizar os resultados, que posteriormente serão analisados por métodos estatísticos
Para verificar ambas as situações, a técnica a utilizar é a eletroforese.
Quando o PCR corre mal:
Usando a eletroforese dizemos que um PCR correu mal sempre que:
- As bandas (ADN amplificado) são pouco definidas ou esbatidas
- Se visualiza mais bandas do que seria de esperar
- Não se visualizam bandas nenhumas, o que significa que a amplificação do ADN nem ocorreu
- Há bandas nos controlos negativos, ou seja, nos controlos que não deveria ter ADN nenhum
- Sempre que os controlos positivos, caso existam, não apresentem banda nenhuma.
Um PCR mal sucedido pode ter várias consequências, nomeadamente:
- Amplificação de fragmentos de ADN inespecíficos, que não são os escolhidos para o estudo em questão, logo não utilizáveis para análise de dados.
- A ausência de bandas de ADN, ou seja, sem dados para analisar.
- Refazer o protocolo PCR novamente com a consequente perda de tempo, reagentes, consumíveis e recursos humanos traduzindo-se no aumento dos custos financeiros para o projeto em questão.
Eletroforese
O que é?
A eletroforese em gel é uma técnica usada para classificar, separar e visualizar pequenas moléculas biológicas, como fragmentos de ADN, com base em duas propriedades, o tamanho e a carga, através da ação de corrente elétrica.
A análise de ADN por eletroforese é uma das técnicas fundamentais nos laboratórios de pesquisa e de diagnóstico.
Os produtos de amplificação por ISSR-PCR são normalmente visualizados em géis de agarose com uma concentração entre 1.5 a 2% de peso/volume (w/v), para que se consiga uma boa separação das bandas amplificadas para posteriormente ser fácil a determinação das bandas elegíveis para análise (Ng e Tan, 2015).
Algumas aplicações
1 Ciência forense
Comparação de ADN encontrado no local de crimes com o de possíveis suspeitos .
2 Genética
Testes de paternidade, diferenciação de espécies ou linhagens, engenharia genética ou diferenciação de padrões de diversidade genética entre populações de espécies.
3 Microbiologia
Deteção de diferentes patógenos como vírus, bactérias e fungos.
4 Bioquímica
Deteção da expressão de proteínas
Princípios básicos da eletroforese
O princípio da eletroforese é baseado no facto do ADN possuir carga negativa em pH neutro ou alcalino; e que quando imerso numa matriz de gel submetida a um campo elétrico, migra em direção ao polo positivo (ânodo).
A velocidade da migração depende do tamanho da molécula de ADN. Por isso num dado momento da eletroforese, moléculas de tamanhos distintos encontram-se em diferentes pontos da matriz de gel.
A taxa de migração é determinada pelo peso molecular da amostra de DNA; moléculas de menor peso migram mais rápido que as de maior peso, formando as bandas características que serão visualizadas posteriormente.
Como numa receita de cozinha,
para realizar uma eletroforese são necessários ingredientes - chamados de
reagentes - e equipamento
para realizar o processo.
Reagentes
Matriz de polímero, designada de gel
- O tipo de polímero usado depende da aplicação: para separar as moléculas de ADN ou RNA, é geralmente usado um polissacárido (açúcar complexo) designado por agarose.
- O polímero forma uma matriz porosa, como uma esponja ou uma peneira.
- Numa das extremidades do gel existem pequenos orifícios (poços) onde serão colocadas as amostras vindas do PCR.
- No Connect.Gene foi usada agarose, mas existem outras bases como a poliacrilamida.
Marcador de peso molecular
- É uma solução, comprada comercialmente, que contém fragmentos de ADN de vários tamanhos conhecidos, formando uma escala de tamanhos.
- Comparando as bandas das amostras em estudo com as do marcador de peso molecular, é possível calcular o tamanho aproximado dos fragmentos de ADN nas amostras.
Corante de biomoléculas
- Corante incorporado no gel e que é fluorescente quando submetido a luz UV.
- O corante liga-se às biomoléculas quando estas atravessam o gel; submetendo o gel a luz UV o corante floresce e marca a posição das biomoléculas, que surgem em forma de bandas.
Tampão de eletroforese
- Tem por função manter o pH estável durante a eletroforese e manter as condições ideais para a passagem da corrente elétrica e das biomoléculas.
- Há vários tipos de tampão consoante o tipo e tamanho da biomoléculas em estudo.
Tampão de carregamento, loading Dye ou loading buffer
- Usado para aumentar a densidade e dar cor à amostra.
- As amostras vindas do PCR têm densidade semelhante à do tampão de eletroforese, o que significa que sem o loading dye a amostra se iria diluir no tampão, perdendo-se.
- O mais comum é o azul bromofenol.
Onde se realiza a eletroforese
Equipamento base
Tina de eletroforese
Pode ter diversos volumes e é o recipiente que contem o tampão de eletroforese, o gel de agarose e as amostras de PCR.
Apresenta polo positivo (vermelho) e negativo (preto), que quando sujeitos a corrente fecham o circuito elétrico, promovendo a separação do ADN por tamanhos, devido à sua carga negativa.
Fonte de alimentação de corrente elétrica
Fornece uma voltagem, corrente e potência constantes, que irão determinar o sucesso da separação dos fragmentos de ADN.
Transiluminador
Fornece a fonte de UV necessária para visualizar as bandas de ADN.
O corante de biomoléculas quando sujeito a luz UV, floresce e revela a posição dos fragmentos de ADN.
Passo a passo do procedimento da eletroforese
Fatores que influenciam a migração de ADN no gel
Tamanho e conformação do ADN
O tamanho dos fragmentos de ADN é o que mais influencia a migração no gel. Por tamanho entende-se o número de pares de bases (bp) do ADN, ou seja, a sequência linear de nucleótidos.
No entanto, nem sempre o ADN se encontra linear e isso pode alterar a migração do fragmento no gel, ao interferir com a passagem da molécula de ADN pela matriz do gel.
Concentração de agarose no gel
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Basta destacar as palavras que você quer projetar e escolher dentre as várias opções na barra de edição de texto.
Voltagem e tipo de tampão de eletroforese
A concentração de agarose no gel desempenha um papel importante na separação dos fragmentos pois determina a porosidade da matriz do gel.
Quanto maior a concentração do gel menor o tamanho dos poros da matriz.
Concentração muito elevada não permite o movimento de fragmentos grandes, logo influenciam a visualização dos mesmos.
Como promover
bons resultados de eletroforese
Garantir uma boa separação dos tamanhos de ADN
- Ajustar a percentagem de agarose no gel.
- Uma maior percentagem (concentração maior) de agarose melhora a separação de bandas de tamanho mais pequeno e/ou de tamanhos muito semelhantes entre si; uma percentagem menor promove a melhor separação de bandas de tamanhos maiores.
Escolher o tampão de eletroforese adequando ao tipo de amostras em estudo
- Para fragmentos mais longos (> 1000bp) é melhor usar o tampão TAE.
- Para separação de fragmentos mais pequenos usar o tampão TBE, uma vez que os fragmentos de ADN migram cerca de 10% mais lentos em TBE do que em TAE.
Garantir que o gel está completamente imerso no tampão de eletroforese
- O gel deverá estar imerso no tampão de eletroforese com cerca de 3-5mm de tampão a cobrir o gel.
- Pouco tampão a cobrir gel irá resultar em: fraca resolução das bandas, distorção das bandas, ou até mesmo o derreter do gel.
- Tampão de eletroforese em excesso pode também causar problemas na mobilidade das bandas e causar distorção das bandas.
Garantir uma boa resolução das bandas de ADN
- Correr o gel a uma voltagem baixa por mais tempo, faz com que os fragmentos de ADN migrem de uma forma constante e lenta, promovendo a formação de bandas límpidas e de contornos nítidos.
- Ter géis com poços largos e finos, promove uma melhor distribuição das amostras para migração.
- Não pipetar muita quantidade de amostra no poço, muita quantidade significa que há maior probabilidade de as bandas aparecerem com efeito de arrastamento.
- Quando se prevê ter fragmentos de ADN de tamanhos muito pequenos (entre 5 e 500 pares de bases (bp)) usar como base de gel a poliacrilamida em vez da agarose.
Garantir a regra dos 10%
Para cada amostra que se pretende colocar num poço do gel, adicionar 10% mais de volume ao volume de amostra padronizado para o tipo de gel e poços em uso; no pipetar no gel perde-se sempre amostra no processo.
Trocar o tampão de eletroforese
- O tampão de eletroforese deve ser trocado sempre que este aqueça demasiado.
- É normal que no fim de uma eletroforese o tampão esteja morno por causa do tempo que esteve sujeito a corrente elétrica.
- No entanto sempre que se verifique que está quente em vez de morno, este deverá ser substituído por novo para evitar problemas nas eletroforeses seguintes.
Não reutilizar os géis
- Os géis não devem ser reutilizados. Uma vez usados para uma corrida de eletroforese, deverão ser descartados.
- Depois de usado o gel perde a sua consistência e qualidade, condicionando a capacidade de separação no caso de uma reutilização.
Sinais de que a eletroforese correu mal
- O gel apresenta um efeito "smiling"
Causas:
01
Aquecimento desigual do gel causado por uma voltagem demasiado elevada. Deve-se reduzir a voltagem para diminuir as inconsistências da temperatura gerada pela corrente elétrica.
02
Distribuição desigual do campo elétrico ao longo da largura do gel. Deve-se garantir que não há fios soltos, descarnados ou com mau contacto.
- As bandas de ADN estão pouco nítidas ou gel sem bandas
Causas:
01
Quantidade insuficiente de ADN carregado no gel. Deve-se aumentar a quantidade de amostra colocada no poço.
02
Amostra com ADN degradado. Neste caso não há nada a fazer senão repetir o PCR.
03
A corrida de eletroforese correu tempo demais, o ADN atravessou todo o gel e saiu pela extremidade mais próxima do polo positivo. Deve-se fazer outra eletroforese, correr menos tempo, usar voltagem menor para correr mais devagar ou usar um gel mais concentrado em agarose.
- As bandas de ADN estão com efeito de arrastamento
Causas:
01
Amostra com ADN degradado. Neste caso não há nada a fazer senão repetir o PCR.
02
Demasiado ADN carregado no gel. Deve-se diminuir a quantidade carregada nos poços do gel.
03
Condições de eletroforese desadequadas. Ajustar a voltagem, garantir a temperatura do tampão de eletroforese abaixo dos 30ºC e trocar o tampão de eletroforese.
RAD-Seq
Em que consiste a RAD-Seq:
A RAD-Seq, técnica de sequenciação de ADN, sequencia fragmentos do genoma de indivíduos, que pode cobrir entre 0.1 a 10% do genoma selecionado. A técnica consiste basicamente em digerir o ADN em pequenos fragmentos com uma enzima de restrição, ligar a estes adaptadores, e multiplicá-los em maiores quantidades pela técnica de PCR, para que depois possam ser sequenciadas. No projeto Connect.Gene a metodologia utilizada para sequenciação RAD-Seq foi a plataforma ILLUMINA HISEQ.
As amostras Connect.Gene depois de ligadas aos adaptadores, foram também ligadas a um “barcode”- identificador único para cada amostra- o que permitiu que várias amostras pudessem ser conjugadas numa única grande amostra antes de serem aumentadas por PCR e mais tarde sequenciadas. Esta metodologia permitiu diminuir os custos de processamento das amostras, sem diminuir a qualidade de resultados finais. Depois de sequenciadas as plataformas de análise de dados são capazes de diferenciar os vários “barcodes”, separando novamente as diferentes amostras.
Identificação de variante genéticas (SNPs)
Filogenética
Identificação e estudo de germoplasma
Estrutura genéticas de populações
Mapeamento de características genéticas
Estudos e associação genética entre características genéticas e desempenho fenotípico das espécies
Identificação de marcadores moleculares codominates
Aplicações e exemplos a nível mundial
A técnica RAD-Seq pode ser aplicada em diversas áreas e com diversos objetivos.
Floragenex
As amostras do projeto connect.gene foram sequenciadas pela técnica de RAD-Seq na empresa Floragenex, com larga experiência e reputação mundial neste tipo de projetos, com mais de 120 espécies sequenciadas e estando no mercado desde 2007. Sediada em Portland, Oregon (EUA), a Floragenex apresenta parceiros estratégicos por todo o mundo e consequentemente uma equipa capaz de aceitar os projetos mais desafiantes na área de genética.
Análise dos dados RAD-Seq
Existem várias plataformas/software de análise de dados RAD-Seq, entre os quais Stacks, PyRAD, dDocent, Rainbow, RADTolls, RADProc, Disco Snp-RAD and AftrRAD. Todas elas promovem a organização de fragmentos genéticos por homologia baseados no número de diferenças entre bases azotadas e percentagem de similaridade.
Os resultados Connect.Gene foram inicialmente analisados pelo software
STACKS, que pode ser encontrado na plataforma
GALAXY, de livre acesso a qualquer utilizador. O Galaxy é uma plataforma web orientada para análise bioinformática.
STACKS
O Stacks é um software usado para identificação de
loci a partir de sequências curtas, com o intuito de construir mapas genéticos, genómica de populações e filogeografia. Este software divide-se em diversas sub- categorias, cada uma delas com objetivos de análise específicos, como à frente descrito.
Process radtags
Esta plataforma explora os resultados de RAD-Seq obtidos através da técnica ILLUMINA para: identificar se os “barcode” estão intactos: os que não estão intactos serão eliminados porque não é possível depois associá-los a uma amostra em específico; e para desmultiplicar as amostras em amostras individuais outra vez, com base nos “barcode” únicos para cada amostra. Depois a plataforma identifica a qualidade dos fragmentos amplificados e sequenciados, em que todos os fragmentos com um índice de qualidade inferior a 90% são descartados, para não enviesarem as análises subsequentes.
Ustacks
Esta plataforma analisa o “output” da plataforma anterior (process radtags), ou seja, analisa os fragmentos sequenciados e alinha-os em “montes” (stacks) exatamente iguais, que correspondem a potenciais alelos. Comparando os “montes” a plataforma irá formar um conjunto de potenciais loci e detetar SNPs (alterações de apenas uma base azotada num fragmento de ADN sequenciado) em cada locus.
populations
Este software irá analisar os resultados das plataformas anteriores considerando populações, originando um conjunto de estatísticas populacionais assim como provendo outputs em diferentes formatos permitindo a sua exportação para outras plataformas de análises. Alguns dos índices calculados são por exemplo heterozigocidade esperada e observada, π (diversidade de nucleótidos) e FIS (coeficiente de inbreeding).
Cstacks
Após processamento pelo UStacks, o CStacks irá contruir um catálogo de loci, unindo vários potenciais alelos.
Sstacks
Os potenciais loci (resultados ustacks) são comparados com o catálogo (resultados CStacks) para determinar que conjunto loci é que cada amostra contém.
Tsv2bam
Esta plataforma irá transpor os dados para que possam estar orientados por locus, ao invés de estarem orientados por amostra.
Gstacks
Esta plataforma irá examinar um locus de cada vez, procurando todas as amostras que contenham este mesmo locus, identificado SNPs para cada locus e para cada amostra (genotipagem), e identificar haplótipos para cada amostra.
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